Оптимизация технологических параметров гидролиза казеина

Молочные белки являются ценным сырьем для получения белковых гидролизатов и активных пептидов, образуемых при гидролизе. Наиболее часто для проведения гидролиза используют различные протеолитические ферменты и бактерии. Важными параметрами регулирования степени гидролиза белков являются продолжительность, температура гидролиза и концентрация биологического агента. Целью исследований является установление оптимальных параметров гидролиза казеина химотрипсином и бактериальной закваской ацидофильной палочки. Для определения оптимальных условий процесса гидролиза использовали трехфакторный эксперимент. В ходе эксперимента варьировались три фактора: время гидролиза (от 6 до 26 ч) с шагом 10 ч; температура (от 32 до 42 °C) с шагом 5 °C; количество закваски (от 0,5 до 1,5 %) с шагом 0,5 %. Зависимой переменной являлась степень гидролиза. Содержание общего азота в казеине определяли методом Кьельдаля, аминного азота — формольным титрованием. Влияние независимых переменных на зависимую переменную анализировали с помощью MathCAD, где также были построены поверхности отклика. Для полученных уравнений множественной регрессии определяли надежность уравнения по коэффициенту детерминации (R2) и критерию Фишера (Fkr), статистическую значимость параметров уравнения множественной регрессии по критерию Стьюдента (t). Получено два уравнения регрессии процесса гидролиза казеина химотрипсином и бактериальной закваской. Установлены коэффициенты детерминации, подтверждающие высокую значимость моделей. Построены поверхности отклика, показывающие зависимость степени гидролиза от параметров гидролиза, установлены оптимальные параметры гидролиза ферментом химотрипсином (например, при продолжительности гидролиза 21,99 ч, температуре 43,3 °C, количестве фермента 0,02 % степень гидролиза составит 28,6 %) и закваской ацидофильной палочки (например, при продолжительности гидролиза 31,1 ч, температуре 35,8 °C, количестве закваски 1,5 % степень гидролиза составит 17,33 %). Таким образом, результаты проведенного многофакторного эксперимента позволили установить оптимальные параметры гидролиза для получения гидролизатов казеина химотрипсином и закваской ацидофильной палочки.

1. Zaky, A. A., Simal-Gandara, J., Eun, J. B., Shim, J. H., Abd El-Aty, A. M. (2022). Bioactivities, applications, safety, and health benefits of bioactive peptides from food and by-Products: A review. Frontiers in Nutrition, 8, Article 815640. https://doi.org/10.3389/fnut.2021.815640

2. Lorenzo, J. M., Munekata, P. E. S., Gómez, B., Barba, F. J., Mora, L., Pérez-Santaescolástica, C. et al. (2018). Bioactive peptides as natural antioxidants in food products — A review. Trends in Food Science and Technology, 79, 136–147. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2018.07.003

3. Nielsen, S.D., Beverly, R.L., Qu, Y., Dallas, D.C. (2017). Milk bioactive peptide database: A comprehensive database of milk protein-derived bioactive peptides and novel visualization. Food Chemistry, 232, 673–682. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.04.056

4. Najafian, L. (2023). A review of bioactive peptides as functional food ingredients: Mechanisms of action and their applications in active packaging and food quality improvement. Food and Function, 14, 5835–5857. https://doi.org/10.1039/ D3FO00362K

5. Lemes, A. C., de Oliveira Filho, J. G., Fernandes, S. S., Gautério, G. V., Egea, M. B. (2023). Bioactive Peptides from Protein-Rich Waste. Chapter in a book: Agricultural Waste: Environmental Impact, Useful Metabolites and Energy Production. Sustainable Development and Biodiversity. Springer, Singapore, 2023. https://doi.org/10.1007/978-981-19-8774-8_6

6. Chourasia, R., Phukon, L. C., Singh, S. P., Rai, A. K., Sahoo, D. (2020). Role of enzymatic bioprocesses for the production of functional food and nutraceuticals. Chapter in a book: Biomass, Biofuels, Biochemicals, Elsevier, 2020. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-819820-9.00015-6

7. Castañeda-Valbuena, D., Berenguer-Murcia, Á., Fernandez-Lafuente, R., Morellon-Sterling, R., Tacias-Pascacio, V. G. (2022). Biological activities of peptides obtained by pepsin hydrolysis of fishery products. Process Biochemistry, 120, 53–63. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2022.05.029

8. Vaishnav, A., Mehta, N. K., Hussain, S. A., Acharya, P. Ch., Biswal, S., Nath, H. et al. (2025). Bromelain excised hydrolysates with potent bioactivity from Bellamya bengalensis soft tissues: Process optimization and characterization. Journal of Agriculture and Food Research, 19, Article 101595. https://doi.org/10.1016/j.jafr.2024.101595

9. Coscueta, E. R., Batista, P., Gomes, J. E. G., da Silva, R., Pintado, M. M. (2022). Screening of novel bioactive peptides from goat casein: In silico to in vitro validation. International Journal of Molecular Sciences, 23(5), Article 2439. https://doi.org/10.3390/ijms23052439

10. Korhonen, H. (2009). Milk-derived bioactive peptides: From science to applications. Journal of Functional Foods, 1(2), 177–187. https://doi.org/10.1016/j.jff.2009.01.007

11. Ugwu, C. P., Abarshi, M. M., Mada, S. B., Sanusi, B., Nzelibe, H. Ch. (2019). Camel and horse milk casein hydrolysates exhibit angiotensin converting enzyme inhibitory and antioxidative effects in vitro and in silico. International Journal of Peptide Research and Therapeutics 25, 1595–1604. https://doi.org/10.1007/s10989-018-09802-2

12. Bamdad, F., Shin, S. H., Suh, J. -W., Nimalaratne, C., Sunwoo, H. (2017). Antiinflammatory and antioxidant properties of casein hydrolysate produced using high hydrostatic pressure combined with proteolytic enzymes. Molecules, 22(4), Article 609. https://doi.org/10.3390/molecules22040609

13. Moita, T., Pedroso, L., Santos, I., Lima, A. (2025). Casein and casein-derived peptides: Antibacterial activities and applications in health and food systems. Nutrients, 17, Article 1615. https://doi.org/10.3390/nu17101615

14. Ren, R., Liu, L., Li, X., Zhang, X., Xu, M., Zhang, Z. et al. (2026). Identification and in-silico screening of ACE inhibitory peptides from casein hydrolysate via fermentation with different probiotics. International Dairy Journal, 172, Article 106425. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2025.106425

15. Mada, S. B., Abaya, P. C., James, D. B., Abarshi, M. M., Tanko, M. S. (2020). Milkderived bioactive peptides with antiosteoporotic effect: A mini review. FUDMA Journal of Sciences, 4(3), 351–357. https://doi.org/10.33003/fjs 2020-0403-277

16. Wang, X., Yuan, X., Yan, R., Song, J., Ren, C., Li, H. et al. (2025). Purification, characterization, and functional validation of a novel casein complex enzyme hydrolysate-binding calcium. Food Chemistry, 476, Article 143438. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.143438

17. Duan, C., Zhang, L., Wu, C., Zhang, Y., Ma, F., Li, X. et al. (2025). An exploration on the structural characteristics and antioxidant activities of casein hydrolysates fermented by Lactiplantibacillus plantarum A56 and A157. Food Bioscience, 65, Article 106069. https://doi.org/10.1016/j.fbio.2025.106069

18. Jauhiainen, T., Rönnback, M., Vapaatalo, H., Wuolle, K., Kautiainen, H., Korpela, R. (2007). Lactobacillus helveticus fermented milk reduces arterial stiffness in hypertensive subjects. International Dairy Journal, 17(10), 1209–1211. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2007.03.002

19. Quirós, A., Ramos, M., Muguerza, B., Delgado, M. A., Miguel, M., Aleixandre, A. et al. (2007). Identification of novel antihypertensive peptides in milk fermented with Enterococcus faecalis. International Dairy Journal, 17(1), 33–41. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2005.12.011

20. Baars, T., van Esch, B., Diks, M., van Ooijen, L., Zhang, Z., Dekker, P. et al. (2025). Bacterial diversity, bioactive peptides, and enhanced immunomodulatory effects in raw milk kefir made with defined starter cultures versus backslopping. International Dairy Journal, 164, Article 106202. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2025.106202

21. Zhou, S., Xu, T., Zhang, X., Luo, J., An, P., Luo, Y. (2022). Effect of casein hydrolysate on cardiovascular risk factors: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Nutrients, 14(19), Article 4207. https://doi.org/10.3390/nu14194207

22. Thomsen, J. P. S., Poulsen, N. A., Larsen, L. B. (2026). Effect of enzymatic dephosphorylation on in vitro digestion of purified bovine caseins. International Dairy Journal, 172, Article 106426. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2025.106426

23. Stokes, T., Hector, A. J., Morton, R. W., McGlory, C., Phillips, S. M. (2018). Recent perspectives regarding the role of dietary protein for the promotion of muscle hypertrophy with resistance exercise training. Nutrients, 10(2), Article 180. https://doi.org/10.3390/nu10020180

24. Jiang, Y., Li, S., Yuan, R., Tuo, Y., Mu, G., Jiang, S. (2024). Preparation of casein hydrolysate by two-step enzymatic hydrolysis and its immunomodulatory activities in vitro and in vivo. Food Bioscience, 59, Article 104007. https://doi.org/10.1016/j.fbio.2024.104007

25. Bueno-Gavilá E., Abellán A., Girón-Rodríguez F., Cayuela J. M., Salazar E., Gómez R. et al. (2019). Bioactivity of hydrolysates obtained from bovine casein using artichoke (Cynara scolymus L.) proteases. Journal of Dairy Science, 102(12), 10711–10723. https://doi.org/10.3168/jds.2019-16596

26. Китаевская, С. В., Пономарев, В. Я., Решетник, О. А. (2022). Оценка протеолитической активности новых штаммов лактобацилл с криорезистентными свойствами. Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология, 12(1), 76–86. https://doi.org/10.21285/2227-2925-2022-12-1-76-86

27. Zhao, L., Gao, P., Zhang, Y., Wang, X., lu, S., Yue, C. et al. (2024). Measurement of degree of hydrolysis and molecular weight distribution of protein hydrolysates by liquid chromatography-mass spectrometry. Talanta, 268(Part 1), Article 125347. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2023.125347

28. Cruz-Casas, D. E., Chávez-García, S. N., García-Flores, L. A., Martínez-Medina, G. A., Ramos-González, R., Prado-Barragán, L. A. et al. (2023). Bioactive peptides from fermented milk products. Chapter in a book: Foundations and Frontiers in Enzymology, Enzymes Beyond Traditional Applications in Dairy Science and Technology, Academic Press, 2023. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-96010-6.00010-2

29. Doneva, M., Dyankova, S., Terziyska, M., Metodieva, P., Nacheva, I. (2024). Antioxidant protein hydrolysates from hemp seed oil cake — optimization of the process using response surface methodology. Applied Sciences, 14(19), Article 8602. https://doi.org/10.3390/app14198602

30. Santos, B. A. S., Azambuja, S. P. H., Ávila, P. F., Pacheco, M. T. B., Goldbeck, R. (2020). n-Butanol production by Saccharomyces cerevisiae from protein-rich agro-industrial by-products. Brazilian Journal of Microbiology, 51, 1655–1664. https://doi.org/10.1007/s42770-020-00370-6

31. Mirzaei Teshnizi, Z., Robatjazi, S. M., Mosaabadi, J. M. (2020). Optimization of the enzymatic hydrolysis of poultry slaughterhouse wastes using alcalase enzyme for the preparation of protein hydrolysates. Applied Food Biotechnology, 7(3), 153–160. https://doi.org/10.22037/afb.v7i3.28417

32. Fang, K.-X., Sun, X., Chen, L.-K., Wang, K., Yang, C.-J., Mei, S.-S. et al. (2025). A novel integrated strategy for discovering absorbable anticoagulant bioactive peptides: A case study on leech protein hydrolysates. Molecules, 30(15), Article 3184. https://doi.org/10.3390/molecules30153184

33. Остроумов, Л. А., Бабич, О. О., Милентьева, И. С. (2013). Оценка состава и физико-химических свойств ферментативных гидролизатов казеина. Вестник ВСГУТУ, 1(40), 82–85.

34. Knuf, F., Caspers-Weiffenbach, R., Schieber, A., Fontana, A. (2025). Peptidomics profiling and biological activities of grape pomace protein hydrolysates. Food Chemistry, 463(Part 1), Article 141032. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.141032

35. Damen, D., Thibodeau, J., Gaaloul, S., Fliss, I., Labrie, S., Hamoudi, S. et al. (2024). Influence of enzymatic hydrolysis conditions on antimicrobial activities and peptide profiles of milk protein-derived hydrolysates from white wastewater. Cleaner Waste Systems, 9, Article 100172. https://doi.org/10.1016/j.clwas.2024.100172

36. Habib, M., Singh, S., Hanan, E., Jan, K., Bashir, K. (2025). Optimization of enzymatic hydrolysis for obtaining antioxidant hydrolysates from pumpkin seed protein: Improvement of the physicochemical, structural and functional properties. Applied Food Research, 5(2), Article 101272. https://doi.org/10.1016/j.afres.2025.101272

37. Лепилкина, О. В., Григорьева, А. И. (2023). Ферментативный протеолиз при преобразовании молока в сыр. Пищевые системы, 6(1), 36–45. https://doi.org/10.21323/2618-9771-2023-6-1-36-45

38. Lotfi, M., Keshvari, T., Taghizadeh, M. S., Afsharifar, A., Moghadam, A., Aram, F. et al. (2025). Optimizing Camelina sativa oil extraction and its cytotoxicity using RSM by emphasis on antioxidant properties, physical characteristics, and molecular docking insights. Industrial Crops and Products, 224, Article 120334. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2024.120334

39. Ren, J., Yu, D., Li, N., Liu, S., Xu, H., Li, J. et al. (2023). Biological characterization and whole-genome analysis of Bacillus subtilis MG 1 isolated from mink fecal samples. Microorganisms, 11(12), Article 2821. https://doi.org/10.3390/microorganisms11122821

40. Reale, A., Di Stasio, L., Di Renzo, T., De Caro, S., Ferranti, P., Picariello, G. et al. (2021). Bacteria do it better! Proteomics suggests the molecular basis for improved digestibility of sourdough products. Food Chemistry, 359, Article 129955. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129955

41. Zhao, Q., Shi, Y., Wang, X., Huang, A. (2020). Characterization of a novel antimicrobial peptide from buffalo casein hydrolysate based on live bacteria adsorption. Journal of Dairy Science, 103(12), 11116–11128. https://doi.org/10.3168/jds.2020-18577

42. Курбанова, М. Г., Бондарчук, О. Н., Масленникова, С. М. (2013). Практические аспекты гидролиза казеина молока эндопептидазами. Техника и технология пищевых производств, 2(29), 34–39.

43. Милентьева, И. С., Давыденко, Н. И., Расщепкин, А. Н. (2020). Подбор рабочих параметров для проведения направленного протеолиза казеина с целью получения биопептидов. Техника и технология пищевых производств, 50(4), 726–735. https://doi.org/10.21603/2074-9414-2020-4-726-735

44. Агаркова, Е. Ю., Кручинин, А. Г. (2018). Ферментативная конверсия как способ получения биологически активных пептидов. Вестник МГТУ. Труды Мурманского государственного технического университета, 21(3), 412– 419.