Использование пуллуланазы в качестве биокатализатора процесса гидролиза крахмала. Часть 1. Изучение действия пуллуланазы на амилопектиновый кукурузный крахмал

Использование деразветвляющих ферментов при гидролизе крахмала является актуальным направлением для получения новых видов крахмалопродуктов с контролируемыми свойствами и потенциалом для дальнейшего использования. Целью работы являлось изучение действия пуллуланазы (ЕС 3.2.1.41) на кукурузный амилопектиновый крахмал в нативном и клейстеризованном состоянии. Объектами исследований являлись амилопектиновый кукурузный крахмал и ферментный препарат Promozyme D6 (Novozymes, Дания). Для определения углеводного состава гидролизатов применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), массовую долю редуцирующих веществ (РВ) определяли методом Лейна и Эйнона, для измерения динамической вязкости продуктов гидролиза крахмала был использован ротационный вискозиметр. Выявлено, что в нативном состоянии испытуемый крахмал проявил невысокую ферментативную восприимчивость к действию пуллуланазы с незначительными изменениями вязкости, растворимости и йодсвязующей способности образцов. Показано, что наибольшую активность на клейстеризованный крахмал пуллуланаза проявляла в первые 8 часов инкубации. Установлено, что максимальная степень гидролиза крахмала пуллуланазой через 8 часов при дозе 10 ед/г сухого вещества (СВ) составила 4,7% по СВ, йодсвязующая способность гидролизата D₆₀₀ –0,343, при этом в контрольном опыте она составила D₆₀₀ –0,154, а вязкость гидролизата снизилась с 7887 мПас · с до 4,3 мПа · с. Гидролизаты, охлажденные до 8 °C и выдержанные в течение 20 часов наряду с неохлажденными, проявили высокую атакуемость глюкоамилазой на 97–98% при 60 °C и 24 часа осахаривания, что указывало на отсутствие их резистентности к действию глюкоамилазы в условиях опыта. Использование пуллуланазы при декстринизации клейстеризованного и частично гидролизованного α-амилазой (РВ 6,1%) испытуемого крахмала позволяло получать гидролизаты с массовой долей редуцирующих веществ в пределах 10–24% по СВ при продолжительности процесса от 2 до 24 часов и дозировке фермента 2–10 ед., которые содержали в основном мальтотриозу, мальтогексозу и мальтогептозу с их суммарным количеством 45–60% по СВ. Результаты свидетельствуют о необходимости продолжения исследований биокаталитического действия пуллуланазы для разработки новых способов ферментативной модификации крахмала.

1. Raveendran, S., Parameswaran B., Ummalyma, S. B., Abraham, A., Mathew, A.K., Madhavan, A. et al. (2018). Applications of microbial enzymes in food industry. Food Technology and Biotechnology, 56(1), 16–30. https://doi.org/10.17113/ftb.56.01.18.5491

2. Shinde, V., Deshmukh, S., Bhoyar, M.G. (2015). Applications of major enzymes in food industry. Indian Farmer, 2(6), 497–502.

3. Hashim, S.O. (2020). Starch-modifying enzymes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,172, 221–244. https://doi.org/10.1007/10_2019_91

4. Tester, R.F., Karkalas J., Qi X. (2004). Starch structure and digestibility enzyme-substrate relationship. World’s Poultry Science Journal, 60(2), 186–195+248+250. https://doi.org/10.1079/WPS20040014

5. Klaochanpong, N., Puttanlek, C., Rungsardthong, V., Rungsardthong V., Puncha-arnon, S., Uttapap, D. (2015). Physicochemical and structural properties of debranched waxy rice, waxy corn and waxy potato starches. Food Hydrocolloids, 45, 218–226. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2014.11.010

6. Hii, S.L., Tan, J.S., Ling, T.C., Ariff, A.B. (2012). Pullulanase: role in starch hydrolysis and potential industrial application. Enzyme research, 2012, Article 921362. https://doi.org/10.1155/2012/921362

7. Manners, D.J. (1997). Observations of the specifity and nomenclature of starch debranching enzymes. Journal of Applied Glycoscience, 44, 83–85.

8. Xia, W., Zhang, K., Su, L., Wu, J. (2021). Microbial starch debranching enzymes: Developments and applications. Biotechnology Advances, 50, Article 107786. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107786

9. Xu, P., Zhang, S.-Y., Luo, Z.-G., Zong, M.-H., Li, X.-X., Lou, W.-Y. (2021). Biotechnology and bioengineering of pullulanase: state of the art and perspectives. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 37(3), Article 43. https://doi.org/10.1007/s11274–021–03010–9

10. Соловьева, С.Ю. (2004). Разработка технологии биоконверсии крахмала при производстве патоки различного углеводного состава. Автореф. дис. канд. техн. наук. Москва, МГУПП. — 25 с.

11. Li, C., Kong, H., Yang, Q., Gu, Z., Ban, X., Cheng, L. et al. (2020). A temperature-mediated two-step saccharification process enhances maltose yield from high-concentration maltodextrin solutions. Journal of the Science of Food and Agriculture, 101(9), 3742–3748. https://doi.org/10.1002/jsfa.11005

12. Xie, A.-J., Lee, D.-J., Lim, S.-T. (2021). Characterization of resistant waxy maize dextrins prepared by simultaneous debranching and crystallization followed by acidic or enzymatic hydrolysis. Food Hydrocolloids, 121, Aticle 106942. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2021.106942

13. Arp, C. G., Correa, M. J., Ferrero, C. (2020). Production and characterization of type III resistant starch from native wheat starch using thermal and enzymatic modifications. Food and Bioprocess Technology, 13(7), 1181–1192. https://doi.org/10.1007/s11947–020–02470–5

14. Li, H., Li, J., Xiao, Y., Cui, B., Fang, Y., Guo, L. (2019). In vitro digestibility of rice starch granules modified by β-amylase, transglucosidase and pullulanase. International Journal of Biological Macromolecules, 136, 1228-1236. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.06.111

15. Li, P., He, X., Dhital, S., Zhang, B., Huang, Q. (2017). Structural and physicochemical properties of granular starches after treatment with debranching enzyme. Carbohydrate Polymers, 169, 351–356. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2017.04.036

16. Jung, K.-H., Kim, M.-J., Park, S.-H., Hwang, H.-S., Lee, S., Shim, J.-H. et al. (2013). The effect of granule surface area on hydrolysis of native starches by pullulanase. Starch — Stärke, 65(9–10), 848–853. https://doi.org/10.1002/star.201200226

17. Hong, Y., Liu, G., Gu, Z. (2015). Preparation and characterization of hydrophilic debranched starch modified by pullulanase on swollen granule starch. Food Research International, 67, 212–218. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2014.11.020

18. Xu, R, Xu, D.-H., Xu, H.-H. (2012). Effect of enzymatic hydrolysis on the resistant starch yield. Italian Journal of Food Science, 24(4), 367–375.

19. Gao, Q, Li, S., Jian, H., Liang, S. (2011). Preparation and properties of resistant starch from corn starch with enzymes. African Journal of Biotechnology, 10(7), 1186–1193.

20. Shi, J., Sweedman, M. C., Shi, Y.-C. (2018). Structural changes and digestibility of waxy maize starch debranched by different levels of pullulanase. Carbohydrate Polymers, 194, 350–356. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2018.04.053

21. ГОСТ 32159–2013 «Крахмал кукурузный. Общие технические условия». — Москва: Стандартинформ, 2019. — 12 с.

22. ГОСТ 34440–2018 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения амилолитической активности». Москва: Стандартинформ, 2018. —18 с.

23. ГОСТ 7698–93 «Крахмал. Правила приемки и методы анализа». Минск: Издательство стандартов, 2001. — 43 с.

24. ГОСТ 33917–2016 «Патока крахмальная. Общие технические условия». — Москва: Стандартинформ, 2017. — 52 с.

25. ГОСТ Р 50549–93 (ИСО 5377–81) «Продукты гидролиза крахмала. Определение восстанавливающей способности и эквивалента глюкозы. Метод постоянного титра Лейна и Эйнона». — Москва: Издательство стандартов, 1994. — 11 с.

26. ГОСТ ISO 6647–1–2015 «Рис. Определение содержания амилозы. Часть 1. Контрольный метод». — Москва: Стандартинформ, 2015. — 16 с.

27. Лукин, Н.Д., Ананских, В.В., Лапидус, Т.В., Хворова, Л.С. (2007). Технологический контроль производства сахаристых крахмалопродуктов. Москва: Россельхозакадемия, 2007. — 261с.

28. Wasserman, L.A., Papachin, A.A., Borodina, Z.M., Krivandin, A.V., Sergeev, A.I., Tarasov, V.F. (2019). Some physico-chemical and thermodynamic characteristics of maize starches hydrolyzed by glucoamylase. Carbohydrate Polymers, 212, 260–269. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2019.01.096

29. Папахин, А.А., Бородина, З.М., Лукин, Н.Д., Гулакова, В.А., Маннова И. Г. (2014). Методика оценки действия оценки действия амилолитических ферментов на нативный крахмал. Хранение и переработка сельхозсырья, 4, 14–17.

30. Папахин, А.А, Бородина, З.М. (28–30 октября 2020 года). Действие глюкоамилазы на различные виды крахмала в нативном состоянии. Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва: ООО «Экспобиохим-технологии», Россия, 2020. https://doi.org/10.37747/2312-640X-2020–18–284–285

31. Šárka, E., Dvořáček, V. (2017). Waxy starch as a perspective raw material (a review). Food Hydrocolloids, 69, 402–409. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2017.03.001

32. Liu, W., Hong, Y., Gu, Z., Cheng, L., Li, Z., Li, C. (2017). In structure and in vitro digestibility of waxy corn starch debranched by pullulanase. Food Hydrocolloids, 67, 104–110. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2016.12.036

33. Shi, M., Chen, Y., Yu, S., Gao, Q. (2013). Preparation and properties of RS III from waxy maize starch with pullulanase. Food Hydrocolloids, 33(1), 19–25. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2013.02.018