Влияние лиофилизации и криопротекции на выживаемость культур Lactiplantibacillus plantarum

Лиофилизация на протяжении многих лет признается эффективным методом сохранения коллекционных культур, бактериальных заквасок и пробиотиков. Для защиты бактериальных клеток от стрессовых воздействий в процессе замораживания и сушки, для повышения их выживаемости используются различные криопротекторы. Целью исследования была оценка влияния трех режимов замораживания перед лиофильной сушкой при температуре минус 20, 30 и 55 °C и растворов двух криопротекторов — сахарозы и трегалозы на выживаемость и сохранение метаболической активности мезофильных лактобацилл. Культуры выращивали в 10 % обезжиренном молоке, в опытных вариантах к исследуемой культуре добавляли 20 % раствор криопротектора в соотношении 4:1. Для определения влияния условий лиофильной сушки на выживаемость и метаболическую активность бактерий, были разработаны и проведены полные двухфакторные трёхуровневые эксперименты. В качестве представительных микроорганизмов лактобацилл исследовали два штамма вида Lactiplantibacillus plantarum из коллекции ВНИИМС, которые используются в составе бактериальных заквасок для сыров. Результаты оценки жизнеспособности бактерий после лиофилизации показали, что оба криопротектора повышают выживаемость культур при всех режимах замораживания, но лучшие показатели выживаемости получены с использованием трегалозы. Установлена штамм-зависимость эффективности лиофилизации исследованных образцов: у штамма Lactiplantibacillus plantarum 28 максимальная выживаемость была выявлена при использовании температуры замораживания минус 30 °C, у штамма Lactiplantibacillus plantarum 37 — при температуре минус 55 °C с добавлением криопротектора трегалозы к обоим штаммам. Для сохранения метаболической активности обеих культур наилучшим было предварительное замораживание при температуре минус 20 °C и также с трегалозой. Показано, что наибольшая эффективность действия сахарозы и трегалозы в качестве лиопротекторов при лиофильной сушке, для обоих штаммов бактерий находится в одном и том же диапазоне температур предварительного замораживания близкой к минус 30 °C. Выявленная штамм-зависимость эффективности лиофилизации должна учитываться при выборе режимов сушки различных коллекционных культур, предназначенных для длительного хранения, и предполагает  индивидуальный подход к каждой культуре. Полученные результаты также могут быть использованы при лиофильной сушке бактериальной массы при производстве моновидовых бактериальных заквасок.

1. Охапкина, В. Ю. (2009). Методы поддержания микробных культур. Часть 2. Лиофилизация. Теоретическая и прикладная экология, 4, 21–32.

2. Rockinger, U., Funk, M., Winter, G. (2021). Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences, 110(8), 2873– 2893. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2021.04.018

3. Wang, J., Chen, L. (2021). Impact of a novel nano-protectant on the viability of probiotic bacterium Lactobacillus casei K17. Foods, 10(3), Article 529. https://doi.org/10.3390/foods10030529

4. Papadimitriou, K., Alegría, Á., Bron, P. A., de Angelis, M., Gobbetti, M., Kleerebezem, M. et al. (2016). Stress physiology of lactic acid bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 80(3), 837–890. https://doi.org/10.1128/mmbr.00076-15

5. Cheng, Z., Yan, X., Wu, J., Weng, P., Wu, Z. (2022). Effects of freeze drying in complex lyoprotectants on the survival, and membrane fatty acid composition of Lactobacillus plantarum L1 and Lactobacillus fermentum L2. Cryobiology, 105, 1–9. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2022.01.003

6. Santivarangkna, C., Kulozik, U., Foerst, P. (2008). Inactivation mechanisms of lactic acid starter cultures preserved by drying processes. Journal of Applied Microbiology, 105(1), 1–13. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2008.03744.x

7. Ge, S., Han, J., Sun, Q., Zhou, Q., Ye, Z., Li, P. et al. (2024). Research progress on improving the freeze-drying resistance of probiotics: A review. Trends in Food Science and Technology, 147, Article 104425. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2024.104425

8. Reddy, K.B.P.K., Awasthi, S.P., Madhu, A.N., Prapulla, S.G. (2009). Role of cryoprotectants on the viability and functional properties of probiotic lactic acid bacteria during freeze drying. Food Biotechnology, 23(3), 243–265. https://doi.org/10.1080/08905430903106811

9. Синева, А.Н., Терехова, Л.П. (2018). Долгосрочное хранение микроорганизмов. Глава в книге: Результаты исследований естественных и точных наук: междисциплинарный подход и cверхаддитивный эффект. Самара: Поволжская научная корпорация, 2018.

10. Rakchai, N., Maneerat, S. (2022). Improved survival of freeze-dried Lactobacillus pentosus Sy130 and applied as a Co-culture starter with Lactobacillus plantarum Kj03 for fermenting stink bean (Sataw-Dong). Indian Journal of Microbiology, 62(2), 215–224. https://doi.org/10.1007/s12088-021-00997-5

11. Stefanello, R.F., Nabeshima, E.H., Iamanaka, B.T., Ludwig, A., Fries, L.L.M., Bernardi, A.O. et al. (2019) Survival and stability of Lactobacillus fermentum and Wickerhamomyces anomalus strains upon lyophilisation with different cryoprotectant agents. Food Research International, 115, 90–94. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2018.07.044

12. Nguyen, T. H., Kim, J.-S., Kwon, H.-J., Kang, C.-H. (2023). The effect of a glutathione (Gsh)-Containing cryo-protectant on the viability of probiotic cells using a freezedrying process. Fermentation, 9(2), Article 187. https://doi.org/10.3390/fermentation9020187

13. Polo, L., Manes-Lazaro, R., Olmeda, I., Cruz-Pio, L.E., Medina, Á., Ferrer, S. et al. (2017). Influence of freezing temperatures prior to freeze-drying on viability of yeasts and lactic acid bacteria isolated from wine. Journal of Applied Microbiology, 122(6), 1603–1614. https://doi.org/10.1111/jam.13465

14. Yang, Y., Wang, R.-X., Yang, Y.-X., E, J.-J., Wang, J.-G. (2022). Effects of different prefreezing temperatures on the freeze-drying survival rate and stability during room temperature storage of Lactiplantibacillus plantarum LIP 1. Food Bioscience, 50, Article 102087. https://doi.org/10.1016/j.fbio.2022.102087

15. Chen, Z., E, J., Ma, R., Zhang, J., Yao, C., Wang, R., Zhang, Q. et al. (2022). The effect of aspartic acid on the freeze-drying survival rate of Lactobacillus plantarum LIP 1 and its inherent mechanism. LWT, 155, Article 112929. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2021.112929

16. Heravi, R.M., Ghiasvand, M., Rezaei, E., Kargar, F. (2022). Assessing the viability of three Lactobacillus bacterial species protected in the cryoprotectants containing whey and maltodextrin during freeze-drying process. Letters in Applied Microbiology, 74(4), 505–512. https://doi.org/10.1111/lam.13631

17. Li, X m., Che, L h., Wu, Y., Li, C., Xu, B c. (2024). An effective strategy for improving the freeze-drying survival rate of Lactobacillus curvatus and its potential protective mechanism. Food Bioscience, 58, Article 103794. https://doi.org/10.1016/j.fbio.2024.103794

18. Haiping, L., Pei, Z., Shuhai, Z., Dengyun, Z., Herong, F., Su, Y., et al. (2019). Protective effect of polysaccharides from Pholiota nameko on Lactobacillus casei ATCC334 subjected to freeze-drying. LWT, 115, Article 108463. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.108463

19. Кириленко, М.А., Кузнецов, О.Ю., Дмитриева, Ж.М. (2019). Влияние криоконсервации на выживаемость комплекса аутоштаммов лактобактерий при хранении и процессах биотехнологического масштабирования. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю. А. Овчинникова, 15(2), 5–10.

20. Archacka, M., Białas, W., Dembczyński, R., Olejnik, A., Sip, A., Szymanowska, D. et al. (2019). Method of preservation and type of protective agent strongly influence probiotic properties of Lactococcus lactis: A complete process of probiotic preparation manufacture and use. Food Chemistry, 274, 733–742. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.09.033

21. Lee, S.-B., Kim, D.-H., Park, H.-D. (2016). Effects of protectant and rehydration conditions on the survival rate and malolactic fermentation efficiency of freezedried Lactobacillus plantarum Jh287. Applied Microbiology and Biotechnology, 100(18), 7853–7863. https://doi.org/10.1007/s00253-016-7509-5

22. Oluwatosin, S. O., Tai, S. L., Fagan-Endres, M. A. (2021). Sucrose, maltodextrin and inulin efficacy as cryoprotectant, preservative and prebiotic-towards a freeze dried Lactobacillus plantarum topical probiotic. Biotechnology Reports, 33, Article e00696. https://doi.org/0.1016/j.btre.2021.e00696

23. Cui, S., Hu, M., Sun, Y., Mao, B., Zhang, Q., Zhao, J. et al. (2023). Effect of trehalose and lactose treatments on the freeze-drying resistance of lactic acid bacteria in high-density culture. Microorganisms, 11(1), Article 48. https://doi.org/10.3390/microorganisms11010048

24. Gao, X., Kong, J., Zhu, H., Mao, B., Cui, S., Zhao, J. (2022). Lactobacillus, Bifidobacterium and Lactococcus response to environmental stress: Mechanisms and application of cross-protection to improve resistance against freeze-drying. Journal of Applied Microbiology, 132(2), 802–821. https://doi.org/10.1111/jam.15251

25. Wang, G.-Q., Pu, J., Yu, X.-Q., Xia, Y.-J., Ai, L.-Z. (2020). Influence of freezing temperature before freeze-drying on the viability of various Lactobacillus plantarum strains. Journal Dairy Sciences, 103(4), 3066–3075. https://doi.org/10.3168/jds.2019-17685

26. Yuste, A., Arosemena, E. L., Calvo, M. (2021). Study of the probiotic potential and evaluation of the survival rate of Lactiplantibacillus plantarum lyophilized as a function of cryoprotectant. Scientific Reports, 11(1), Article 19078. https://doi.org/10.1038/s41598-021-98723-0

27. Kavak, A.E., Zent, İ., Özdemir, A., Dertli, E. (2024). Optimization of cryoprotectant formulation to enhance the viability of Lactiplantibacillus plantarum NBC99 isolated from human origin. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 54(7), 958–966. https://doi.org/10.1080/10826068.2024.2312450

28. Mafaldo, M., de Medeiros, ´V.P.B.., da Costa, W.K.A.., da Costa Sassi, C.F., da Costa Lima, M., de Souza, E.L. et al. (2022). Survival during long-term storage, membrane integrity, and ultrastructural aspects of Lactobacillus acidophilus 05 and Lacticaseibacillus casei 01 freeze-dried with freshwater microalgae biomasses. Food Research International, 159, Article 111620. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2022.111620

29. Qu, Y., Yu, C., Gan, T., Huang, B., Huang, S., Yu, J. et al. (2023). Protective effect of crop by-products on Lactobacillus gasseri H87 during freeze-drying and storage. Drying Technology, 41(10), 1595–1604. https://doi.org/10.1080/07373937.2023.2167828

30. Явников, Н.В. (2022). Влияние различных криопротекторных компонентов на выживаемость пробиотических микроорганизмов после лиофильной сушки. Международный вестник ветеринарии, 1, 69–73. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2022.1.69

31. Marcial-Coba, M.S., Cieplak, T., Cahú, T.B., Blennow, A., Knøchel, S., Nielsen, D.S. (2018). Viability of microencapsulated Akkermansia muciniphila and Lactobacillus plantarum during freeze-drying, storage and in vitro simulated upper gastrointestinal tract passage. Food and Function, 9(11), 5868–5879. https://doi.org/10.1039/c8fo01331d

32. Savedboworn, W., Teawsomboonkit, K., Surichay, S., Riansa-Ngawong, W., Rittisak, S., Charoen, R. et al. (2019). Impact of protectants on the storage stability of freeze-dried probiotic Lactobacillus plantarum. Food Science and Biotechnology, 28(3), 795–805. https://doi.org/10.1007/s10068-018-0523-x