Электронно-микроскопические исследования кинетики структурообразования молочного геля

Цель этой работы заключается в улучшении понимания механизма ферментативного гелеобразования в молоке за счёт визуализация эволюции его микроструктуры с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Для снижения возможности возникновения артефактов препарирования и устранения проблем достоверной интерпретации получаемых изображений в работе были использованы три различных способа подготовки препаратов к исследованиям: оттенение топографии поверхности вакуумным напылением тяжелого металла; негативное окрашивание препарата раствором тяжелого металла; репликация скола быстрозамороженного образца. Выбор моментов времени отбора образцов геля в процессе его эволюции обусловлен наиболее вероятными существенными изменениями в образующемся геле. В результате исследований показано, что с точки зрения статистической термодинамики натуральное молоко является неравновесной системой. Отмечено, что волосковый слой казеиномакропептидов на поверхности мицелл казеина распределён неравномерно, что способствует образованию димеров и тримеров мицелл. Определено, что в первичной фазе ферментативного гелеобразования в молоке образуются слабосвязанные кластеры мицелл в местах их наибольшей концентрации. Образования цепочек мицелл на этом этапе не наблюдается, что объясняется отсутствием анизометрии мицелл и энергетической невыгодностью их образования. Установлено, что при ферментативном гелеобразовании в молоке вблизи гель-точки запускается иерархический процесс преобразований белковой составляющей молока. Спусковым механизмом этого процесса является кооперативный конформационный фазовый переход в кластерах мицелл казеина, который вызывает цепочку более энергоёмких реакций в последовательности: гидрофобные взаимодействия → водородные связи → электростатические взаимодействия → кальциевые мостики. Результатом чего является преобразование слабосвязанных кластеров мицелл в более плотные агрегаты, преимущественно из которых окончательно формируется молочный сгусток. Отмечено, что в целом гелеобразование в молоке можно рассматривать как процесс, снижающий величину свободной энергии, а определение того, как уровень снижения величины свободной энергии молока при гелеобразовании связано с физическими свойствами готового сыра и других молочных продуктов остаётся актуальной темой исследований.

1. Lucey, J. A. (2011). Rennet-induced coagulation of milk. Chapter in a book: Encyclopedia of Dairy Sciences. Oxford: Academic Press. 2011.

2. Fox, P. F., Guinee, T. P., Cogan, T. M., McSweeney, P. L. H. (2017). Fundamentals of Cheese Science. Springer, New York. 2017.

3. Amaro-Hernández, J. C., Olivas, G. I., Acosta-Muñiz, C. H., Gutiérrez-Méndez, N., Rios-Velasco, C., Sepulveda, D. R. (2022). Chemical interactions among caseins during rennet coagulation of milk, Journal of Dairy Science, 105(2), 981–989. https://doi.org/10.3168/jds.2021-21071

4. Ptitsyn, O. B. (1995). Molten globule and protein folding. Chapter in a book: Advances in Protein Chemistry. 1995. https://doi.org/10.1016/S0065-3233(08)60546-X

5. Farrell Jr., H. M., Qi, P. X., Brown, E. M., Cooke, P. H., Tunick, M. H., Wickham, E. D. et al. (2002). Molten globule structures in milk proteins: Implications for potential new structure-function relationships. Journal of Dairy Science, 85(3), 459–471. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(02)74096-4

6. Fox, P. F., Guinee, T. P. (2013). Cheese science and technology. Chapter in a book: Milk and Dairy Products in Human Nutrition. Oxford, Wiley Blackwell.2013.

7. Smykov, I. T. (2015). Kinetics of Milk Gelation. Part I. Coagulation Mechanism. Chapter in a book: Rheology: Principles, applications and environmental impacts. New York: Nova Science Publ. 2015.

8. Surkov, B. A., Klimovskii, I. I., Krayushkin, V. A. (1982). Turbidimetric study of kinetics and mechanism of milk clotting by rennet. Milchwissenschaft, 37, 393–395.

9. Mosler, A. B., Shaqfeh, E. S. G. (1997). The conformation change of model polymers in stochastic flow fields: Flow through fixed beds. Physics of Fluids, 9, 1222–1234. https://doi.org/10.1063/1.869262

10. Markoska, T., Vasiljevic, T., Huppertz, T. (2020). Unravelling conformational aspects of milk protein structure-contributions from nuclear magnetic resonance studies. Foods, 9(8), Article 1128. https://doi.org/10.3390/foods9081128

11. Horne, D. S., Lucey, J. A. (2017). Rennet-Induced Coagulation of Milk. Chapter in a book: Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Oxford: Academic Press. 2017. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417012-4.00005-3

12. Fox, P. F., Guinee, T. P., Cogan, T. M., McSweeney, P. L. H. (2016). Enzymatic Coagulation of Milk. pp.185–229. Chapter in a book: Fundamentals of Cheese Science, Springer Nature, New York. 2013. https://doi:10.1007/978-1-4899-7681-9_7

13. Tuszynski, W. B. (1971). A kinetic model of the clotting of casein by rennet.Journal of Dairy Research, 38(2), 115–125. https://doi.org/10.1017/S0022029900019233

14. Witten Jr., T. A., Meakin, P. (1983). Diffusion-limited aggregation at multiple growth sites. Physical Review B, 28(10), 5632–5642. https://doi.org/10.1103/PhysRevB.28.5632

15. De Kruif, C. G., Holt, C. (2003). Casein micelle structure, functions and interactions. Chapter in a book: Advanced Dairy Chemistry — 1 Proteins. Springer, Boston, MA. 2003.

16. Salvador, D., Acosta, Y., Zamora, A., Castillo, M. (2022). Rennet-induced casein micelle aggregation models: A review. Foods. 11(9), Article 1243. https://doi.10.3390/foods11091243

17. Kalab, M. (1979). Microstructure of dairy foods. 1. Milk products based on protein. Journal of Dairy Science, 62(8), 1352–1364.

18. Ong, L., Li, X., Ong, A., Gras, S. L. (2022). New insights into cheese microstructure. Annual Review of Food Science and Technology, 13, 89–115. https://doi.org/10.1146/annurev-food-032519-051812

19. Serna-Hernandez, S. O., Escobedo-Avellaneda, Z., García-García, R., Rostro-Alanis, M. D. de J., Welti-Chanes, J. (2022). Microscopical evaluation of the effects of high-pressure processing on milk casein micelles. Molecules, 27, Article 7179. https://doi.org/10.3390/molecules27217179

20. Panthi, R. R., Kelly, A. L., Sheehan, J. J., Bulbul, K., Vollmer, A.H., McMahon, D. J. (2019). Influence of protein concentration and coagulation temperature on rennet-induced gelation characteristics and curd microstructure. Journal of Dairy Science, 102(1), 177–189. https://doi.org/10.3168/jds.2018-15039

21. Li, R., Ebbesen, M. F., Glover, Z. J., Jæger, T. C., Rovers, T. A. M., Svensson, B. et al. (2023). Discriminating between different proteins in the microstructure of acidified milk gels by super-resolution microscopy. Food Hydrocolloids, 138, Article 108468. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2023.108468

22. Zhang, Y., Liu, D., Liu, X., Hang, F., Zhou, P., Zhao, J. et al. (2018). Effect of temperature on casein micelle composition and gelation of bovine milk. International Dairy Journal, 78, 20–27. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2017.10.008

23. Foroutanparsa, S., Brüls, M., Tas, R. P., Maljaars, C. E. P., Voets, I. K. (2021). Super resolution microscopy imaging of pH induced changes in the microstructure of casein micelles. Food Structure, 30, Article 100231. https://doi.org/10.1016/j.foostr.2021.100231

24. Glover, Z. J., Ersch, C., Andersen, U., Holmes, M. J., Povey, M. J., Brewer, J. R. et al. (2019). Super-resolution microscopy and empirically validated autocorrelation image analysis discriminates microstructures of dairy derived gels. Food Hydrocolloids, 90, 62–71. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2018.12.004

25. Karlsson, A. O., Ipsen, R., Ardo, Y. (2007). Observations of casein micelles in skim milk concentrate by transmission electron microscopy. LWT — Food Science and Technology, 40(6), 1102–1107. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2006.05.012

26. Matsko, N., Letofsky-Papst, I., Albu, M., Mittal, V. (2013). An analytical technique to extract surface information of negatively stained or heavy-metal shadowed organic materials within the TEM. Microscopy and Microanalysis, 19(3), 642–651. https://doi.org/10.1017/S1431927613000366

27. Kavanagh, G. M., Clark, A. H., Ross-Murphy, S. B. (2000). Heat-induced gelation of globular proteins: 4. Gelation kinetics of low pH β-Lactoglobulin gels. Langmuir, 16, 24, 9584–9594. https://doi.org/10.1021/la0004698

28. Hayat, M. A. (2000). Principles and techniques of electron microscopy: Biological applications. Cambridge University Press. 2000.

29. Dalgleish, D. G., Spagnuolo, P., Goff, H. D. (2004). A possible structure of the casein micelle based on high-resolution field-emission scanning electron microscopy. International Dairy Journal, 14(12), 1025–1031. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2004.04.008

30. Casanova, H., Chen, J., Dickinson, E., Murray, B. S., Nelson, P. V., Whittle, M. (2000). Dynamic colloidal interactions between protein stabilized particles — experiment and simulation. Physical Chemistry Chemical Physics, 2(17), 3861–3869. https://doi.org/10.1039/b004023l

31. de Kruif, C. G. (1998). Supra-aggregates of casein micelles as a prelude to coagulation. Journal of Dairy Science, 81(11), 3019–3028. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(98)75866-7

32. Shamsi, K. (2008). Effects of Pulsed Electric Field Processing on Microbial, Enzymatic and Physical Attributes of Milk and the Rennet-Induced Milk Gel. RMIT University, Melbourne. 2008.