Идентификация видов рыбы с помощью технологии секвенирования нового поколения (NGS)

Законы о маркировке рыбы и рыбной продукции, требующие указывать информацию о видовой принадлежности рыбы, есть во многих странах мира. Данные правила обусловлены высоким ростом количества случаев экономического мошенничества в области производства и оборота рыбных продуктов. Распространенными способами мошенничества являются подмена и  неправильная маркировка продукта, что подтверждается многочисленными исследованиями. Анализ научных работ показал, что применение неправильной маркировки при производстве рыбных продуктов в разных странах встречается в 30–70% случаев. Для их предотвращения имеющегося законодательства о прослеживаемости пищевых продуктов недостаточно, что указывает на необходимость принятия строгих мер контроля, обеспечивающих эффективную видовую идентификацию рыбы и рыбопродуктов. В настоящее время для идентификации их видовой принадлежности используют различные лабораторные тесты, главным образом основанные на анализе уникальных профилей ДНК, которые обнаружены у различных видов. В данной работе представлен метод определения видовой принадлежности рыб с использованием секвенирования нового поколения (NGS). Технология секвенирования NGS является передовой в области контроля качества рыбной продукции, особенно для идентификации видов рыб в многокомпонентной продукции, в которой помимо целевой ДНК присутствуют и фрагменты ДНК других видов. Секвенирование NGS проводили на платформе Ion Torrent Ion GeneStudio S5 System, были проанализированы двадцать образцов, 17 коммерческих образцов и 3 приготовленных опытных образца, состоящих их смеси двух и более видов. Были подобраны и подготовлены универсальные праймеры, способные амплифицировать фрагмент 16S rRNA промысловых видов рыб. В целом в ходе анализа была идентифицирована ДНК 11 семейств, 15 родов и 16 видов. Полученный результат секвенирования NGS17 коммерческих образцов подтверждал результаты идентификации другими молекулярно-диагностическими методами, была выявлена неправильная маркировка в 4 образцах. В 3 опытных образцах были идентифицированы все виды рыб, входящих в их состав. Была произведена оценка возможных причин замены рыбы.

1. Barbuto, M., Galimberti, A., Ferri, E., Labra, M., Malandra, R., Galli, P. et al. (2010). DNA barcoding reveals fraudulent substitutions in shark seafood products: The Italian case of “palombo” (Mustelus spp.). Food Research International, 43(1), 376–381. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2009.10.009

2. Международная сеть органов по безопасности пищевых продуктов (ИНФОСАН). Электронный ресурс https://www.who.int/foodsafety/fs_management/infosan_1007_ru.pdf Дата обращения 15.03.2022

3. ИНФОСАН No. 3/2006 — Пищевые аллергии. Электронный ресурс https://www.who.int/foodsafety/fs_management/No_03_allergy_June06_ru.pdf Дата обращения 15.03.2022.

4. CXS1–1985 General Standard for the Labelling of Prepackaged Foods. Retrieved from https://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/shproxy/en/?lnk=1&url=https%253A%252F%252Fworkspace.fao.org%252Fsites %252Fcodex%252FStandards%252FCXS%2B1–1985%252FCXS_001e.pdf Accessed March 14, 2022.

5. Pinto, A.D., Pinto, P.D., Terio, V., Bozzo, G., Bonerba, E., Ceci, E. et al. (2013). DNA barcoding for detecting market substitution in salted cod fillets and battered cod chunks. Food Chemistry, 141(3), 1757–1762. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.05.093

6. Rasmussen, R. S., Morrissey, M. T. (2008). DNA based methods for the identification of commercial fish and seafood species. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 7(3), 280–295. https://doi.org/10.1111/j.1541–4337.2008.00046.x

7. Regulation (EC) No 1224/2009 establishing a system for ensuring compliance with the common fisheries policy. Retrieved from https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/LSU/?uri=CELEX%3A32009R1224 Accessed March 14, 2022

8. Regulation (EC) No 178/2002 of the European Parliament and of the Council of 28 January 2002 laying down the general principles and requirements of food law, establishing the European Food Safety Authority and laying down procedures in matters of food safety. Retrieved from https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=celex%3A32002R0178 Accessed March 14, 2022

9. Regulation (EU) No 1379/2013 of the European Parliament and of the Council of 11 December 2013 on the common organisation of the markets in fishery and aquaculture products, amending Council Regulations (EC) No 1184/2006 and (EC) No 1224/2009 and repealing Council Regulation (EC) No 104/2000 Retrieved from https://eur-lex.europa.eu/legalcontent/EN/TXT/?uri=CELEX%3A32013R1379&qid=1649920599842 Accessed March 14, 2022

10. Marko, P. B., Lee, S. C., Rice, A. M., Gramling, J. M., Fitzhenry, T. M., McAlister, J. S. et al. (2004). Mislabeling of a depleted reef fish. Nature, 430(6997), 309–310. https://doi.org/10.1038/430309b

11. Logan, C. A., Alter, S. E., Haupt, A. J., Tomalty, K., Palumbi, S. R. (2008). Animpediment to consumer choice: overfished species are sold as Pacific red snapper. Biological Conservation, 141(6), 1591–1599.

12. Pardo, M. A., Jiménez, E., Pérez-Villarreal, B. (2016). Misdescription incidents in seafood sector. Food Control, 62, 277-283. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.10.048

13. Von Der Heyden, S., Barendse, J., Seebregts, A. J., Matthee, C. A. (2010). Misleading the masses: detection of mislabelled and substituted frozen fish products in South Africa. ICES Journal of Marine Science, 67(1), 176– 185. https://doi.org/10.1093/icesjms/fsp222

14. Verrez-Bagnis, V., Sotelo, C. G., Mendes, R., Silva H., Kappel, K., Schröder, U. (2019). Methods for seafood authenticity testing in Europe. Reference Series in Phytochemistry, 2063–2117. https://doi.org/10.1007/978–3–319–78030–6_69

15. Agnew, D. J., Pearce, J., Pramod, G., Peatman T., Watson R., Beddington, J. R. et al. (2009). Estimating the worldwide extent of illegal fishing. PLoS ONE, 4(2), Article e4570. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004570

16. Galimberti, A., De Mattia, F., Losa, A., Bruni, I., Federici, S., Casiraghi, M. et al. (2013). DNA barcoding as a new tool for food traceability. Food Research International, 50(1), 55–63. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2012.09.036

17. Rasmussen Hellberg, R. S., Morrissey, M. T. (2011). Advances in DNA based techniques for the detection of seafood species substitution on the commercial market. Journal of Laboratory Automation, 16(4), 308– 321. https://doi.org/10.1016/j.jala.2010.07.004

18. Bybee, S.M., Bracken-Grissom, H., Haynes, B.D., Hermansen R. A., Byers R. L., Clement M. J. et al. (2011). Targeted amplicon sequencing (TAS): A scalable next-gen approach to multilocus, multitaxa phylogenetics. Genome Biology and Evolution, 3(1), 1312–1323. https://doi.org/10.1093/gbe/evr106

19. Rusk, N. (2010). Torrents of sequence. Nature Methods, 8(1), 44–44. https://doi.org/10.1038/nmeth.f.330

20. Purushothaman, S., Toumazou, C., Ou, C.-P. (2006). Protons and single nucleotide polymorphism detection: A simple use for the Ion Sensitive Field Effect Transistor. Sensors and Actuators B: Chemical, 114(2), 964– 968. https://doi.org/10.1016/j.snb.2005.06.069

21. МР 4.2.0019–11 Методические рекомендации. 4.2. Методы контроля. Биологические факторы. Идентификация сырьевого состава мясной продукции. Электронный ресурс https://www.rospotrebnadzor.ru/upload/iblock/e6f/mr4.2.0019_11.pdf Дата обращения 15.03.2022.

22. Murray, M. G., Thompson, W. F. (1980). Rapid isolation of higher weight DNA. Nuclear Acids Research, 8(19), 4321–4325. https://doi.org/10.1093/nar/8.19.4321

23. Boom, R., Sol, C. J. A., Salimans, M. M. M., Jansen C. L., Wertheim-Van Dillen, P. M. E., Van Der Noordaa, J. (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology, 28(3), 495–503. https://doi.org/10.1128/jcm.28.3.495–503.1990

24. Алексеев, Я. И. (2017). Разработка технологии молекулярно-генетического анализа генетически модифицированных сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки. Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, 2017.

25. FDA. (2012). DNA based seafood identification. Retrieved from https://www.fda.gov/food/science-research-food/dna-based-seafoodidentification Accessed March 01, 2022

26. Wong, E. H.-K., Hanner, R. H. (2008). DNA barcoding detects market substitution in North American seafood. Food Research International, 41(8), 828–837. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2008.07.005

27. Панин, А. (2021). В каких консервах сайру заменяют более дешевой рыбой? Электронный ресурс https://rskrf.ru/tips/spetsproekty/v-kakikh-konservakh-sayru-zamenyayut-bolee-deshevoy-ryboy/ Дата обращения 01.02.2022.

28. Торговые сети продают дешевую восточную скумбрию под видом дорогой атлантической. Электронный ресурс https://www.spbkontrol.ru/ekspertizy2020/773-torgovye-seti-prodayut-deshevuyuvostochnuyu-skumbriyu-pod-vidom-dorogoj-atlanticheskoj Дата обращения 14.03.2022.

29. Giusti, A., Armani, A., Sotelo, C. G. (2017). Advances in the analysis of complex food matrices: Species identification in surimi-based products using Next Generation Sequencing technologies. Plos ONE, 12(10), Article e0185586. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185586

30. Park, J.Y., Lee, S.Y., An, C.M., Kang J.-H., Kim J.-H., Chai J. C. et al. (2012). Comparative study between Next Generation Sequencing Technique and identification of microarray for Species Identification within blended food products. Biochip Journal, 6(4), 354–361. https://doi.org/10.1007/s13206–012–6407-x

31. Bertolini, F., Ghionda, M.C., D’Alessandro, E., Geraci C., Chiofalo, V., Fontanesi, L. (2015). A next generation semiconductor based sequencing approach for the identification of meat species in DNA mixtures. PLoS One, 10(4), Article 0121701. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0121701

32. Tillmar, A.O., Dell’Amico, B., Welander, J., Holmlund, G. (2013). A universal method for species identification of mammals utilizing next generation sequencing for the analysis of DNA mixtures. PLoS One, 8, Article e83761. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083761